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    脂質體介導的瞬時轉染

    發布時間: 2022-12-06  點擊次數: 713次

    材料與儀器

    L8057-Y10細胞 D-PBSA
    培養瓶 培養板 F12 FB培養基 G418(Invitrogen) 選擇性培養基 電穿孔 電穿孔專用杯 電穿孔儀II 電穿孔儀-II配套的效能擴增器-Plus

    步驟

    表達載體與 DNA 制備:

    pSVTKGH,線性化 [ Selden et al.,1986]

    此載體含有 SV 40 增強子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子序列,兩者可啟動人類生 K 激素(hGH ) 基因表達。hGH 可直接分泌到組織培養基上,可通過放射免疫學分析法直接檢測 [ Ravid et al.,1991 ]。

    pcDNA3,線性化(Invitrogen )

    該表達載體在多克隆位點上游含有人類巨細胞病毒增強子-啟動子,下游含多聚腺苷酸信號及牛生長激素(bGH ) 基因的轉錄終止序列。pcDNA3 載體還含有新霉素抗藥基因,用作篩選穩定表達目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述,pcDNA3 也可用作與報告基因載體共轉染的篩選標記。

    1. 以 5X105個/ml 的濃度在 75 cm2 培養瓶中接種 L8057-Y10 細胞(F12/FB 培養基)(含谷氨酰胺(2 mmol/L ),青霉素(50 U/ml ) 及鏈霉素(5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (熱滅活;GIBCO #16140-014)),并于 37°C,5% CO2 孵箱培養細胞。

    2. 在對數生長后期,收集細胞,4°C ,380 g 離心 5 min。

    3. 用 10ml D-PBSA 洗滌細胞沉淀,4°C,380 g 離心 5 min。

    4. 用 5 ml 電穿孔緩沖液洗滌細胞沉淀,用血細胞計數儀計數細胞。

    5. 4°C,380 g 再次離心 5 min,收集細胞。

    6. 用電穿孔緩沖液將細胞制成密度為 1X106 個/0.8 ml 的細胞懸液。

    7. 將 0.8 ml 的細胞移至預冷的電穿孔杯中。

    8. 分別加入 50 μg 和 5 μg 線性 pSVTKGH 及線性 pcDNA3 (如果實驗目的是檢測特異基因啟動子-報告基因表達,還需另設無質粒 DNA 的電穿孔細胞,作為陰性對照)

    9. 一只手緊握電穿孔杯,另一只手輕彈底部,以混勻 DNA-細胞懸液,將懸液于冰上孵育 10 min。

    10. 在 400V /500 μF 條件下轟擊細胞懸液,并記錄時間。

    11. 之后,取出電穿孔杯,在冰上擱置 10 min。

    12. 將轟擊后的細胞移至盛有 10 ml F12/FB 的離心管中,另取少許培養基沖洗電穿孔杯,移回到離心管,離心,收集細胞。

    13. 將細胞于 20 m l F12/FB 中再次懸浮,種到 75 cm2 培養瓶中,于37°C ,5 %CO2 培養箱中孵育,令新霉素抗性基因表達。

    14. 24~48 h 后,離心收集細胞,然后用 20 ml 選擇性培養基中再次懸浮細胞。

    15. 隨后,需每 2~4 天換液(選擇性培養基),以清除死亡細胞的碎片,并且使抗性細胞生長,篩選過程至少需要兩周。

    16. 測定 hGH 在細胞上清液的表達(見 27. 11.5 節)。


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