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    多潛能干細(xì)胞的誘導(dǎo)

    發(fā)布時間： 2022-12-02　　點擊次數(shù)： 925次

    簡介

     

    多潛能干細(xì)胞（in-duced pluripotent stem cells，iPS）技術(shù)不僅可以解決胚胎干細(xì)胞來源引起的倫理問題，而且自體 iPS 細(xì)胞可以避免異體來源胚胎干細(xì)胞移植引起的免疫排斥反應(yīng)。目前就成體細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞相關(guān)的幾種轉(zhuǎn)錄因子以及誘導(dǎo)方法、如何提高誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPS 細(xì)胞的效率以及 iPS 細(xì)胞臨床應(yīng)用方面都是在 Yamanaka 報道的誘導(dǎo)方案基礎(chǔ)上的改良。

     

    原理

     

    Yamanaka 法誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的原理是把 Oct3/4，Sox2、c-Myc 和 Klf4 這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的 iPS 細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。

     

     

    材料與儀器

     

    器材：

    ① 37 ℃ 水浴鍋

    ② 一次性無菌培養(yǎng)皿

    ③ 一次性無菌移液管

    ④ T75 培養(yǎng)瓶

    ⑤ 涂有明膠的 6 孔板

    ⑥ 15 ml 離心管、注射器和針頭

    試劑：

     

    ① 材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞

    ② DMEM 培養(yǎng)基

    ③ 胎牛血清

    ④ 谷酰胺

    ⑤ 非必需氨基酸

    ⑥ DF12 培養(yǎng)基

     

    ⑦ 血清替代物
    ⑧ 谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液
    ⑨ b-FGF 溶液
    ⑩ β-巰基乙醇

     

    步驟

     

    多潛能干細(xì)胞的誘導(dǎo)的基本過程可分為如下幾步：

    （一）試劑配制


    （1）MEF 培養(yǎng)基的配制 DMEM 培養(yǎng)基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 熱滅活 30 min），50 ml；200 mmol/L-谷酰胺，5 ml；非必需氨基酸，5 ml。將所有組分混合后，用 0.22 μm 濾器過濾除菌，4 ℃ 保存，保持無菌。

    （2）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 DF12 培養(yǎng)基，200 ml；血清替代物，50 ml；200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液，1.25 ml；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 ml；b-FGF 溶液，5 ml。所有組分都加入 250 ml 培養(yǎng)瓶中，用 0.22 μm 濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在 2 周內(nèi)使用。

     

    （3）200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺（使用前冷凍保存），5 ml；β-巰基乙醇，7 μl。混勻。

    （4）b-FGF 的配制。b-FGF，10 μg；0.1％ BSA 無菌，5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分裝，冷凍保存。

    （二）開始前準(zhǔn)備


    （1）小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的獲得 通過同源重的方法將雙選擇標(biāo)記系統(tǒng)，如βgeo（neo 用于 G418 篩選，βGal 用于顯影）基因盒，同源重組到小鼠 Nanog 基因位點，使βgeo 受內(nèi)源性 Nanog/O）ct 啟動子控制，由于 Nanog 只在 ESC 中表達(dá)，所以來源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的體細(xì)胞由于缺乏 ES 特性，不能在 G418 中生長。按 MEF 制備方法，從 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分離培養(yǎng) Fbx15βgea/βgeo 來源的 MEF。

    （2）經(jīng)典的「Yamanaka」法 OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC 病毒的準(zhǔn)備。

    （3）MEF 飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備。

    （三）細(xì)胞誘導(dǎo)


    （1）感染前一天，將處于對數(shù)生長期的 Fbx15 Pgco/βgeo 來源的 MEF 細(xì)胞鋪于 6 孔培養(yǎng)板，使感染時細(xì)胞達(dá)到 80％ 的匯合。

    （2）按測定的病毒滴度，以 10 個 pfμ/細(xì)胞加入適量濃縮病毒上清，用 MEF 培養(yǎng)基補齊至每個孔 2.5 ml 體積，再加入終濃度為 8 μg/ml 的 polybrene（聚凝胺），混合均勻。

    （3）棄去 Fbx15 βgeo/βgco 來源的 MEF 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，加入上步制備的病毒溶液，6 孔培養(yǎng)板每孔加 2.5 ml 的病毒溶液。37 ℃ 孵育 4 h 到過夜。

     

    （4）換新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基。

    （5）感染后 3 d，向培養(yǎng)基中添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418。

    （6）每 2～3 天換新鮮胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418，進(jìn)行克隆篩選，持續(xù) 2～3 周。

    （7）在培養(yǎng)過程中，觀察克隆形成情況。將其中與 ES 細(xì)胞形狀相似克隆按 ESC 培養(yǎng)方法擴增傳代，并進(jìn)行鑒定。

    （四）實驗結(jié)果及分析


    誘導(dǎo)成功的 iPS 需進(jìn)行多能性的鑒定，鑒定的內(nèi)容包括以下幾方面。

    （1）形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

    （2）生長特性。

     

    （3）發(fā)育潛能：2N 囊胚注射，獲得嵌合體病能通過生殖系遺傳給后代（形成三胚層細(xì)胞并能夠形成配子細(xì)胞遺傳給下一代）；4N 囊胚注射，通過此方法獲得的小鼠，胚外組織來源于 4N 的細(xì)胞，而小鼠則全部來自 iPS 細(xì)胞。

    （4）標(biāo)志分子表達(dá)。

    （5）表觀遺傳學(xué)特性。

     

     

    注意事項

     

    （1）目前已經(jīng)報道的轉(zhuǎn)錄因子的組合有很多，在 Yamanaka 四因子基礎(chǔ)上，還報道的組合有 OCT4，SOX2，NANOG 和 LIN28；OCT4，SOX2 和 KLF4；Sox2，c-Myc 和 Klf4；使用前冷凍保存。按 50 ml 分裝后冷凍保存，使用前融化。
    （2）目前用于過表達(dá)上述核心轉(zhuǎn)錄因子的手段有很多，包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，重組蛋白誘導(dǎo)方法，化學(xué)小分子 ［例如 G9a 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的小分子抑制劑 BIX-01294（BIX）］ 等。
    （3）對于提高誘導(dǎo)效率方面，MSC 作為誘導(dǎo)細(xì)胞其誘導(dǎo)成為 iPS 的效率較皮膚來源成纖維細(xì)胞的比率高：組蛋白脫乙酰基酶抑制劑內(nèi)戊酸（VPA）和新報道的維生素- C 能顯著提高 iPS 的誘導(dǎo)比率。
    （4）陽性克隆的篩選方法包括報告基因篩選和形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)篩選。報告基因篩選方法是指用基因重組技術(shù)建立具有藥物抗性基因的小鼠成纖維細(xì)胞抗性受內(nèi)源性 nanog 或（）ct4 表達(dá)調(diào)控，通過壓力篩選，表達(dá)耐藥基因的克隆優(yōu)勢生長。

     

     

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