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從培養的細胞中純化總RNA的方法
發布時間: 2021-11-24 點擊次數: 986次材料與儀器
細胞
RNA 提取緩沖液 變性液 水飽和酚
培養皿 Falcon 2063 管步驟
1. 取 1 個細胞已長滿的 100 ml 培養皿,吸出培養液,加 2 ml RNA 提取緩沖液,用橡膠刮棒刮下細胞。
RNA 提取緩沖液:
變性液,20 ml
β-巰基乙醇,0.144 ml
2 mol/L 乙酸鈉,pH 4,2 ml
水飽和酚,22 ml
可避光保存在 4℃ 2~3 個月。
變性液:
4 mol/L 硫氰酸胍:250 g 硫氰酸胍
25 mmol/L 檸檬酸鈉:17.6 ml 0.75 mol/L 檸檬酸鈉,pH 7
0.5% 十二烷基肌氨酸鈉(Sarkoayl):26.4 ml 10% 十二烷基肌氨酸鈉,293 ml H2O
混合各組分,在 65℃ 攪拌溶解。可以在室溫保存 3 個月。
水飽和酚:
用在水浴中加熱到 65℃ 的滅菌水來溶解酚。從水浴取出后使冷卻到 4℃。加足量水以維持水相(上相)。可在 4℃ 避光保存 2~3 個月。
2. 細胞裂解物轉移到一個 Falcon 2063 管中,加 200 μl 氯仿,混合均勻。
3. 細胞冰浴 15 分鐘。
4. 細胞裂解物在 4℃ 以 5000 g 離心 30 分鐘。
5. 轉移水(上)相,注意不要攪動交界面,水相放到一個干凈的 Falcon 2063 管中并加入 1 ml 異丙醇(僅用于 RNA 工作的溶液)。
6. 管子在 -20℃ 放至少 1 小時或過夜。
7. 用固定角度的轉頭在 4℃ 以 8000 g 離心 30 分鐘沉淀 RNA,小心去掉上清。
8. 加 1 ml 70% 乙醇洗白色沉淀物并在以 8000 g 離心 15 分鐘。洗 3 次,不要振搖。
9. 最后一次 70% 乙醇洗滌后,去掉乙醇并稍稍離心管子收集殘液。吸掉剩下的乙醇。
10. 短時間干燥沉淀。空氣干燥約 30 分鐘或在真空干燥器中 2~3 分鐘。
11. 用 50~100 μl DEPC 處理過的水重懸 RNA,測量 1:100 稀釋的樣品的光密度(OD260)來計算濃度。
濃度(μg/ml)=(稀釋度)[(40 μg/ml·OD260)](樣品的 OD260)
12. 重懸的 RNA 貯存在 -70℃。- 下一篇:細胞勻漿的操作
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