①膜處理（甲醇 1min，風(fēng)干（放濾紙上），甲醇 1min，水 1min） 

② 封閉（用 TBST 配 5%牛奶）1h 配搖床 

③ 加一抗，牛奶稀釋,所需濃度參考抗體說明書，看膜的大小配多少一抗，4°過夜。 

④ 室溫孵育 20min 

⑤ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配搖床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后，加入 1ml 的 TWEEN20） 

⑥ 加二抗，牛奶稀釋，一般 1:10000，1h 配搖床 

⑦ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配搖床 

⑧ 發(fā)光（A 液 B 液等體積混合，孵膜 1min，正面朝上放入儀器內(nèi)發(fā)光）

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)： 

封閉液的選取具體得看抗體說明書，有的抗體是明確要求只能用 BSA，而且封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況 5%BSA 的效果會(huì)比 5%牛奶要好。 信號通路一般都是用 5%BSA 封閉。 信號通路在洗膜的時(shí)候用快速搖床 5min/次 3 次就可以了。 如果你想省時(shí)間，一抗可以放在 37℃1~2hour，但是一定要封好，以免溫度太高而導(dǎo)致抗體 干了出現(xiàn)假陽性。二抗可以 37℃半個(gè)小時(shí)。 發(fā)光液的選取，如果是一般的抗體，建議用一般的發(fā)光液效果會(huì)好一點(diǎn)，如 keygen 的，背景會(huì)比較干凈。但是一些難發(fā)出來的一般建議用靈敏度更高的發(fā)光液如 FD 的或者是 MILLIPORE 之類的發(fā)光液。