老話說的好，萬事開頭難。而這話在 RT-PCR 中則較為體現出來，其開頭的第一步——將 RNA 反轉為 cDNA，表面上看似簡單，實際上則暗潮洶涌，指不定就在哪里挖個坑，就會讓斗志高昂的實驗汪們摔的鼻青臉腫，而且還不知道是咋掉坑的。 

顯然，RNA 的反轉錄成功，不是想有就能有。大家之所以屢敗屢戰、屢戰屢敗，就是因為忽略了以下這 6 個要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里看著悲催的實驗結果唉聲嘆氣呢？

1.RT Primer 的* 

通常 RT primer 可分為三類：oligo dT，隨機引物以及基因特異性引物。Oligo dT 引物之所以應用范圍更加廣泛，是因為可由此獲得 mRNA 的全長拷貝。 

然而如果 mRNA 長度過長>4kb，或者沒有 polyA 尾（原核 mRNA 或 rRNA），就需要考慮使用隨機引物進行 RNA 的反轉錄。隨機引物雖能確保長基因的 5’末端的轉錄，但并不能獲得整個基因全長的 cDNAs，且對 RNA 樣品質量要求比較高，此時可用 6-8 個核酸聚合體來提高 cDNAs 的合成量。 

而對于真核生物的 qPCR，長隨機引物和 Oligo-dT 引物的混合物似乎能給出一個漂亮的結果。針對此類優化混合引物，已有兩家公司的試劑盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev.  Transcription Kit 和 BioRad iScript Kit。 

第三個選擇就是基因特異性引物，僅擴增需要的 cDNA，適用于目的序列已知的情況。通常在一步 RT-PCR 法中可使用此類引物，因為該引物也可用作為 PCR 中的反向引物。

2.RNA 的二級結構 

若要獲取全長 RNA 的反轉錄，那么 RNA 二級結構的問題就不可忽略，因為反轉錄酶在遇到此類結構后會終止反應或從模板上脫落下來。 

也許你很難判斷 RNA 是否具有二級結構，但如果基因中 GC 含量較高，通常意味著 RNA 很難被變性且不可能是單鏈，此時就需要在 65℃ 5min 對其進行充分變性，以避免其對實驗結果的影響。 

另外，還有一種方法可解決此問題，即使用一種最適溫度高于正常標準（37℃-42℃）的逆轉錄酶。比如來自 Life Technologies 的 Themoscript 酶就常用于具有復雜結構 RNA 的逆轉錄。當然也存在一些即使在常規逆轉錄溫度（37℃-42℃）的條件下，也能跨過 RNA 二級結構的高效率逆轉錄酶，即使是針對富集 GC 序列的 RNA 也能得到很好的結果，如 Qiagen 公司的逆轉錄酶 Omniscript 和 Sensiscript，以及 Takara Bio 公司的 PrimeScirpt RT enzyme。

3.去除 gDNA 

RNA 中存在的基因組 DNA（gDNA）污染可能是最終 PCR 反應中假陽性結果出現的原因，目前已存在很多方法去除 gDNA，比如通過 DNAase 對提取的 RNA 進行預處理。 

以上方法無可避免會造成 RNA 的蛋白污染，因而這里介紹一種可繞開酶處理的方法，即針對 RNA 設計一種包含內含子或內含子-外顯子邊界的引物，如此 DNA 就不會產生擴增抑或即便擴增了其條帶大小也與 cDNA 不同。 

但值得注意的是，使用該方法時基因中要沒有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因組中剪切 mRNA 的 DNA 拷貝，否則也會產生假陽性結果。 

而對于沒有內含子的原核 RNA，gDNA 的去除則更是基因表達準確測量的一個至關重要的因素。使用 DNAase 處理 RNA 是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit 中所包含的 gDNA 清除緩沖液就可在無需加熱或 EDTA 失活的條件下降解 DNA。此外，具有 gDNA Eraser（Takara  Bio）的 PrimeScript RT 試劑盒也可去除 gDNA，且能在不到 20 分鐘之內快速完成 RNA 的 cDNA 合成。

4.檢測 RNA 分子的完整性 

毫無疑問，RNA 質量對 cDNA 合成結果會產生重要的影響，而不同批次間 RNA 質量差異也導致 RT-PCR 產生不同的結果。所以在進行 RT-PCR 前，應該檢查 RNA 條帶的質量，可通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。通常完整的真核 RNA 應包括 28S 和 18S RNA 條帶，且較大的條帶的強度應是較小條帶的兩倍左右，另外兩個條帶強度大致相同也是可以的。 

而另一種準確測量 RNA 質量的方法是使用 Agilent BioAnalzyer 儀器，它可將 RNA 分子可視化并能在分析 RNA 完整數值（RNA Integrity Number，RIN）后給出一個質量的量化標準。RIN 為 8-10，則表示 RNA 質量非常好；當 RIN 值低于 7，則說明 RNA 可能有降解，可能會導致一些罕見信息的丟失等問題。

5.RNA 定量 

除了掌握 RNA 的完整性之外，準確評估產量也很重要。產量的準確性會受到以下因素的影響：測量儀器的準確性、DNA 的污染、鹽的污染以及降解程度。而為了準確測量產量，小編我更喜歡使用 Nanodrop 進行 UV 定量。 

該儀器不需要稀釋樣品，并且具有非常寬的測量 RNA 的范圍。以小編的經驗，它可以準確讀取到 10ng / ul。而傳統的紫外分光光度法應避免使用大容量的比色皿，因為這需要耗費大量的樣品。此法的缺點是也可在樣品中測量基因組 DNA，如果從 RNA 提取過程殘留鹽或酚，則會增加吸光度，使得 RNA 的 OD 值變得更高。 

而解決此問題一個方法是使用熒光染料，Ribogreen 是一種 RNA 特異性染料，可通過熒光來測量 RNA 產量。現在，Nanodrop 已經具備檢測 Ribogreen 所發出熒光的功能。

6.兩步法或一步法 RT-PCR 

RT-PCR 也分兩種類型：一步法（One-step PCR）和兩步法（Two-steps PCR），具體操作見下圖。前者，RT 反應和 PCR 擴增是在同一個反應管中進行的；而后者，RT 反應與 PCR 擴增反應單獨進行。

盡管這兩種方法都能得到最終的結果，但是每種方法都有優缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結它們的優缺點。 

一步 RT-PCR 消除了樣品轉移步驟，不僅消除了控制物污染的潛在來源，而且需要較少的準備和操作時間。又因一步 RT-PCR 中所使用的引物是基因特異性的，靈敏度高，常用于分析低表達水平基因。而其不足在于同一樣本中只有有限數量的目的基因被擴增，且需要在轉錄和擴增間尋找一個平衡。 

所以當時間對實驗很重要時，一般采用一步法，如檢測 RNA 病毒，也適用于高通量分析。由于該法的檢測結果準確率高，因而在需要測量表達水平上的細微差異時，也可采用此方法。 

而兩步 RT-PCR 可將大批量的 RNA 轉化為 cDNA，然后儲存 cDNA 用于后續實驗，可檢測大量基因；在分別優化 RT 和 PCR 步驟后，可更好地控制實驗過程；又因只有少量的轉錄本被用 于 PCR，則任何可能從 RNA 分離到 RT 反應的抑制劑（如乙醇、酚及胍鹽等）都被稀釋了。 

但是兩步 RT-PCR 更耗費時間，且帶來污染的可能性更高；RT 過程應以相同效率反轉錄 RNA， 否則會影響 qPCR 的啟動效率，進而帶來不同的實驗結果，因此對于每個 RT 反應應使用相同的條件。 

如果你需要對同一樣本的多個目標進行分析時，可選擇兩步 RT-PCR。另外，當 RNA 的存儲是個問題時，最好是進行兩步 RT-PCR，因為 cDNA 在-20℃是穩定的。

參考文獻：

1、Six Important Factors for Successful Reverse Transcription 

2、How to Choose the Correct Reverse Transcription Method